DNA的合成有磷酸三酯法、亚磷酰胺法、氢磷酸法等，现在常用的是固相亚磷酰胺法，它具有快速、方便、偶联效率高等特点。一般从3′向5′合成，通过下列四个步骤加上一个核苷酸。 　　
　　
　　第一步：脱保护：用三氯乙酸或二氯乙酸脱去连在固相载体上的核苷酸5′羟基上的保护基团DMT，使它暴露出来进行下一步反应。 　　
　　
　　第二步：偶联：将亚磷酰胺单体用四唑活化，形成高反应性的亚磷酰四唑，进入合成柱，与连在固相载体上的寡核苷酸5′羟基偶联，这一步效率一般在98％以上。 　　
　　
　　第三步：封闭：为了防止少量未反应（＜2％﹞的连在固相载体上的5′羟基进入下一循环，用醋酐对其进行乙酰化封闭，大大提高了最后产品的纯度。 　　
　　
　　第四步：氧化：缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酯转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。 　　
　　
　　经过上面四个步骤，核苷酸被逐个加到合成的寡核苷酸链上。最后用浓氨水把寡核苷酸从固相载体上切割下来，脱去碱基和磷酸基团上的保护基团，随后进行纯化和定量。 纯化方法：寡核苷酸的纯化常用的方法有OPC，HPLC，PAGE，C18等方法。OPC柱中装有对DMT具有亲和力的树脂，合成DNA片段时保留5'端最后一个碱基上的DMT，所有合成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有DMT的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有DMT的片段吸附能力弱，被洗脱。然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去DMT基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。这种方法的优点是快速，简易。但是其专一性吸附DMT能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。特别是对长于25碱基以上的片段纯化效果不好。利用离子交换或反相HPLC纯化寡核苷酸是国外公司常用的方法，它具有自动化程度高、快速、简便的优点，缺点是需要仪器，对长片段效果不理想。PAGE纯化是利用长短片段带的电荷不同，电泳迁移率不同来分离不纯物和产品，它的优点是产品纯度高、质量可靠，是国内许多公司推崇的方法，缺点是实验步骤多，费人工。本公司利用PAGE纯化产品，然后用C18脱盐，也可按照用户的要求对修饰的寡核苷酸进行HPLC纯化。 寡核苷酸的定量：Oligo DNA是以OD260值来计量的。在1cm光程标准石英比色皿中，260nm波长下吸光度为1的１毫升Oligo溶液定义为1 OD260。虽然对于每种特定的寡核苷酸来说，其碱基的组成不尽相同，但1 OD260 Oligo DNA的重量约为33 μg，每个碱基的平均分子量约为330 Da。因此合成的Oligo DNA摩尔数可按以下公式近似计算： 摩尔数(μmol)=[OD值×33]/[碱基数×330] 溶解和保存寡核苷酸：本中心提供的是真空干燥的DNA，呈干膜状或粉末状在离心管底部，可以－20℃或室温长期保存。开启瓶盖时小心不要丢失，请先稍微离心，再加入足量的水充分振荡溶解。溶解DNA的水最好无菌，pH大于7.0。要溶解成所需浓度的寡核苷酸，可按下式计算加入ddH2O的量： 所需水的量（ml）= [OD值×33]/[(碱基数×330) ×所需浓度（μM）]溶解好的DNA最好保存在－20℃，带有荧光标记的引物请注意避光保存